我們的Cell Meter 活細胞半胱天冬酶活性檢測試劑盒基于半胱天冬酶的熒光抑制劑。這些抑制劑具有細胞滲透性和非細胞毒性。一旦進(jìn)入細胞，半胱天冬酶抑制劑與活性半胱天冬酶共價(jià)結合。胱天蛋白酶3/7的激活對于細胞凋亡的起始是重要的。已經(jīng)證明胱天蛋白酶3/7對肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物選擇性。該試劑盒使用TF3-DEVD-FMK作為半胱天冬酶3/7活性的熒光指示劑。TF3-DEVD-FMK在凋亡細胞中不可逆地結合活化的胱天蛋白酶3/7。一旦與胱天蛋白酶3/7結合，熒光試劑保留在細胞內。結合抑制caspase 3/7，但不會(huì )阻止細胞凋亡的進(jìn)行。有多種參數可用于監測細胞凋亡。這種Cell Meter 活細胞半胱天冬酶3/7活性測定試劑盒旨在通過(guò)測量活細胞中胱天蛋白酶3/7的活化來(lái)檢測細胞凋亡。它用于定量凋亡細胞中活化的caspase 3/7活性，或用于篩選caspase 3/7抑制劑。TF3-DEVD-FMK，紅色標記試劑，允許通過(guò)熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀直接檢測凋亡細胞中活化的半胱天冬酶3/7。該試劑盒為所有必需組分提供優(yōu)化的分析方案。

操作方法

1.根據您的特異性誘導方案，將細胞培養至最適于細胞凋亡誘導的密度，但不超過(guò)2 x 10^6個(gè)細胞/ mL。同時(shí)，對于每種標記條件，以與誘導群體相同的密度培養非誘導的陰性對照細胞群。以下是一些誘導懸浮培養細胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜樹(shù)堿處理Jurkat細胞3小時(shí)。

2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細胞3小時(shí)。

3）用4μg/ ml喜樹(shù)堿處理HL-60細胞4小時(shí)。

4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細胞4小時(shí)。

注意：應對每個(gè)細胞系進(jìn)行單獨評估，以確定誘導細胞凋亡的最佳細胞密度。

2.通過(guò)向TF3-DEVD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X TF3-DEVD-FMK DMSO儲備溶液。 將150×TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入細胞溶液中，并將細胞在37℃，5％CO2培養箱中孵育1小時(shí)。

注1：對于TF3-DEVD-FMK標記，細胞可以濃縮至~5×10^6個(gè)細胞/ mL。 未使用的150X TF3-DEVD-FMK DMSO儲備溶液應分為單次使用的等分試樣并儲存在-20°C。

注2：對于粘附細胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在用TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培養基洗滌細胞一次。

注3：適當的孵育時(shí)間取決于所用的細胞類(lèi)型和細胞濃度。 優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗的孵育時(shí)間。

3.將細胞以約200g旋轉5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細胞兩次。 將細胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。

注1：TF3-DEVD-FMK是熒光的，因此清除任何未結合的試劑以消除背景非常重要。

注2：對于分離的細胞，應將細胞濃度調節至每個(gè)微量滴定板孔中2-5×10^5個(gè)細胞/100μL等分試樣，用于步驟5。

4.如果需要，用DNA染色標記細胞（例如用于死細胞的Nuclear Green DCS1，或用于細胞核染色的整個(gè)群體的Hoechst）。

5.通過(guò)熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀在Ex / Em = 550/595 nm處檢測熒光強度（對于Nuclear Green DCS1，Ex / Em = 490/525 nm，對于Hoechst染料，Ex / Em = 350/461 nm）

5.1對于流式細胞儀，使用Ex / Em = 550/595 nm（用于Nuclear Green DCS1染色的FL1通道）的通道監測熒光強度。

5.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標儀。 將100μL細胞懸浮液置于96孔黑色微量滴定板的每個(gè)孔中。

注意：如果需要平衡細胞濃度，調整誘導細胞的懸浮體積以接近非誘導細胞群的細胞密度。 如果您的細胞治療不會(huì )導致受刺激細胞群數量的顯著(zhù)損失，則此調整步驟是可選的。

5.3使用TRITC通道（用于Nuclear Green DCS1染色的FITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）在熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞。

5.4使用熒光酶標儀，使用Ex / Em = 550/595 nm（在570 nm處截止）底部讀取模式監測熒光強度。