膜聯(lián)蛋白是在鈣存在下與磷脂膜結(jié)合的蛋白質(zhì)家族。膜聯(lián)蛋白V是研究細胞凋亡的有用工具。它被用作探針以檢測在細胞表面上表達磷脂酰絲氨酸的細胞，這是細胞凋亡中發(fā)現(xiàn)的特征以及其他形式的細胞死亡。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測細胞活力。膜聯(lián)蛋白V-染料結(jié)合物廣泛用于通過測量磷脂酰絲氨酸（PS）的易位來監(jiān)測細胞凋亡。在細胞凋亡中，PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲氨酸在細胞表面上的出現(xiàn)是細胞凋亡的初始/中間階段的通用指示，并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測到。該熒光FITC-膜聯(lián)蛋白V綴合物廣泛用于通過流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測細胞凋亡。對于基于膜聯(lián)蛋白V的細胞凋亡檢測的微孔板檢測，我們建議您使用我們的Cell Meter 試劑盒。

操作步驟

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1     制備膜聯(lián)蛋白V綴合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl ₂，pH 7.4。

1.2     用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。

1.3     離心細胞，得到1-5×10 ^⁵個細胞/管。

1.4     將細胞重懸于200μLAnnexin V結(jié)合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5     在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6     余ncubate在室溫下進行30至60分鐘，避光。

1.7     在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μLAnnexin V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8     使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

2.使用流式細胞儀分析：

通過使用具有適當過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V 結(jié)合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1     移液器從步驟1.6，將細胞懸浮液沖洗1-2次用甲nnexin V-結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1） ，然后與A重懸細胞 nnexin V-結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1） 。將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物（步驟1.6）孵育后，用Nnexin V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將A nnexin V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2     在熒光顯微鏡下用適當?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞。